Solteiro

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 10093 (2023) Citar este artigo

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A biologia definidora que distingue as armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) de outras formas de morte celular não está resolvida, e as técnicas que identificam inequivocamente as NETs permanecem indefinidas. A medição do espalhamento Raman fornece uma visão holística da composição molecular das células com base nas vibrações de ligação características em componentes como lipídios e proteínas. Coletamos espectros Raman de NETs e congelamos/descongelamos células necróticas usando uma plataforma personalizada de alto rendimento que é capaz de medir rapidamente espectros de células individuais. A análise de componentes principais dos espectros Raman dos NETs os distinguiu claramente das células necróticas, apesar de sua morfologia semelhante, demonstrando suas diferenças moleculares fundamentais. Em contraste, as técnicas clássicas utilizadas para análise de NET, microscopia de imunofluorescência, DNA extracelular e ELISA não conseguiram diferenciar essas células. Além disso, a análise de aprendizado de máquina dos espectros Raman indicou diferenças sutis nos NETs induzidos por lipopolissacarídeo (LPS) em oposição aos NETs induzidos por acetato de miristato de forbol (PMA), demonstrando que a composição molecular dos NETs varia dependendo do estimulante usado. Este estudo demonstra os benefícios da microscopia Raman na discriminação de NETs de outros tipos de morte celular e pela sua via de indução.

As armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) são uma forma de morte celular caracterizada pela quebra do núcleo e liberação de DNA em uma estrutura semelhante a uma nuvem ou fio1,2. Devido à sua natureza delicada e variada, o desenvolvimento de técnicas específicas e diretas para a caracterização dos TNEs tem sido difícil3,4. Embora um grande número de pesquisas tenha demonstrado que a formação de NETs é uma forma controlada e distinta de morte celular2,5, existe uma sobreposição significativa com outras vias de morte celular, e a definição exata de NETs está em debate4. A descondensação e liberação de DNA distinguem os NETs de processos como apoptose, necroptose e piroptose, todos os quais resultam em condensação nuclear6,7. No entanto, os estágios posteriores de muitas vias de morte celular podem resultar na quebra do núcleo e na liberação de DNA, potencialmente confundindo a análise do ponto final. Por exemplo, a necrose secundária, que ocorre após a apoptose, resulta em descondensação do DNA, lise celular e liberação de conteúdo extracelular8,9,10. Além disso, a morte celular não regulada, como a necrose causada diretamente por danos fisiológicos às células, pode resultar em características notavelmente semelhantes à formação de NET. É fundamental distinguir esses tipos de morte celular para entender quais vias estão sendo ativadas para causar a morte celular, como elas podem ser controladas para mitigar possíveis resultados patológicos e se a morte celular é o resultado de insultos fisiológicos ou estresse às células durante o processo. procedimentos experimentais ou é uma via genuína de morte celular programada6.

A detecção e quantificação de NET geralmente depende de uma combinação de medição de DNA extracelular, morfologia celular e marcadores proteicos, sendo os mais comuns a mieloperoxidase (MPO), a elastase de neutrófilos (NE) e as histonas citrulinadas. A medição do DNA extracelular utiliza corantes fluorescentes, como o PicoGreen2, para medir o DNA liberado no sobrenadante. Corantes de DNA impermeáveis, como o Sytox Green, também são frequentemente usados ​​para corar NETs, ​​excluindo células com membrana intacta, permitindo a quantificação por técnicas como a citometria de fluxo . Embora fáceis de implementar, estas técnicas são limitadas devido à sua incapacidade de distinguir NETs de outras formas de morte celular. A análise morfológica melhora isso, mas requer imagens seguidas de contagem manual ou processamento automatizado de imagens16,17,18,19,20. Isso pode ser trabalhoso e introduzir vieses; portanto, marcadores de proteínas são frequentemente introduzidos em um esforço para melhorar a precisão. Além de auxiliar nas técnicas de imagem, marcadores proteicos são utilizados em ELISAs sanduíche, nos quais os NETs são imobilizados com anticorpos proteicos, comumente anti-MPO, e detectados por meio de anticorpos para DNA (ou vice-versa)21,22,23.