Específico e rótulo

Scientific Reports volume 13, Artigo número: 10808 (2023) Citar este artigo

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O músculo distrófico é caracterizado por ciclos de necrose/regeneração, inflamação e desenvolvimento fibro-adipogênico. As colorações histológicas convencionais fornecem dados topográficos essenciais desta remodelação, mas podem ser limitadas para discriminar contextos fisiopatológicos intimamente relacionados. Eles não mencionam mudanças na microarquitetura ligadas à natureza e distribuição espacial dos componentes do compartimento tecidual. Nós investigamos se a autofluorescência tecidual livre de rótulo revelada pela radiação ultravioleta profunda síncrotron (DUV) poderia servir como uma ferramenta adicional para monitorar a remodelação muscular distrófica. Utilizando microscopia de campo amplo com filtros de fluorescência de emissão específicos e microespectroscopia definida por alta resolução espectral, analisamos amostras de cães saudáveis ​​e dois grupos de cães distróficos: animais virgens (gravemente afetados) e animais transplantados com células MuStem (clinicamente estabilizados). Análise estatística multivariada e abordagens de aprendizado de máquina demonstraram que a autofluorescência emitida a 420-480 nm pelo músculo bíceps femoral discrimina efetivamente entre amostras de cães saudáveis, distróficos e transplantados. A microespectroscopia mostrou que o músculo distrófico de cães apresenta maior e menor autofluorescência devido à reticulação de colágeno e NADH, respectivamente, do que cães saudáveis ​​​​e transplantados, definindo biomarcadores para avaliar o impacto do transplante celular. Nossas descobertas demonstram que a radiação DUV é um método sensível e sem rótulo para avaliar o estado histopatológico do músculo distrófico utilizando pequenas quantidades de tecido, com aplicações potenciais na medicina regenerativa.

As distrofias musculares (DM) são um grupo geneticamente heterogêneo de mais de 50 doenças neuromusculares que envolvem o músculo esquelético. Todos eles compartilham fraqueza e atrofia muscular progressiva, mas variam na apresentação clínica e na gravidade dos sintomas1,2. Caracterizam-se por degeneração local ou generalizada das fibras musculares1. A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é a DM mais comum, afetando 1 em cada 3.500–5.500 recém-nascidos do sexo masculino3. Esta doença muscular fatal recessiva ligada ao X é causada por mutações no gene da distrofina, levando à falta de uma proteína funcional essencial para manter a integridade da fibra muscular4. Isso resulta em profunda perturbação da homeostase tecidual caracterizada por alterações na composição das fibras, aumento da variação no tamanho das fibras, centronucleação, inflamação e substituição de fibras musculares por tecidos fibrosos e adiposos5,6.

A caracterização histológica das alterações estendidas no músculo esquelético distrófico fornece informações importantes sobre a fisiopatologia da doença e é uma ferramenta fundamental para avaliar os efeitos de novas estratégias terapêuticas7. Parâmetros teciduais quantificáveis ​​padrão, incluindo o número de fibras, diâmetro de Feret, composição do tipo de fibra, porcentagem de fibras centronucleadas e a proporção de fibrose e adipose, são medidos em seções transversais de músculo esquelético coradas usando técnicas clássicas de coloração topográfica, como hematoxilina-eosina -açafrão (HES), Picrosirius red e tricrômico de Gomori e/ou imunomarcação específica8. No entanto, a avaliação da remodelação do tecido conjuntivo pode por vezes ser mais desafiante: a fibrose endomisial pode ser difícil de quantificar com precisão se a área de superfície ocupada for estritamente considerada sem integrar o arranjo de colagénio dentro da matriz extracelular, que tem demonstrado ser crítico na função mecânica9. Portanto, pode não ser um critério suficientemente discriminativo para uma avaliação precisa da progressão da doença. Da mesma forma, faltam métodos para avaliar a eficácia das estratégias terapêuticas10. Evidências recentes sugerem que a organização da rede de colágeno, e em particular a ligação cruzada do colágeno, constitui um potencial biomarcador de DMD11,12,13. No nível funcional, a reticulação do colágeno desempenha um papel crítico na rigidez muscular e foi analisada por meio de microscopia de luz polarizada e imagens de geração de segundo harmônico (SHG) em seções de tecido coradas com Herovici13 e Picrosirius red. Recentemente, mostramos que a imagem SHG de tecido limpo é uma abordagem poderosa e livre de rótulos para caracterização 3D de fibrose cardíaca em DMD16. Além disso, a autofluorescência de biomacromoléculas em resposta à microscopia ultravioleta profunda síncrotron (DUV) pode constituir um marcador útil para a caracterização ultraestrutural de diferentes tecidos animais17,18,19 e para monitorar a tipagem das fibras musculares e o estado metabólico20,21.