Caracterização molecular das vias de elétrons faltantes para síntese de butanol em Clostridium acetobutylicum

Nature Communications volume 13, número do artigo: 4691 (2022) Citar este artigo

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Clostridium acetobutylicum é um biocatalisador promissor para a produção renovável de n-butanol. Várias estratégias metabólicas já foram desenvolvidas para aumentar os rendimentos de butanol, na maioria das vezes baseadas no redirecionamento da via do carbono. No entanto, já foi demonstrado anteriormente que as atividades da ferredoxina-NADP+ redutase e da ferredoxina-NAD+ redutase, cujos genes codificadores permanecem desconhecidos, são necessárias para produzir o NADPH e o NADH extra necessário para a síntese de butanol sob condições solventegênicas. Aqui, purificamos, identificamos e caracterizamos parcialmente as proteínas responsáveis ​​por ambas as atividades e demonstramos o envolvimento das enzimas identificadas na síntese de butanol através de uma abordagem genética reversa. Demonstramos ainda que o rendimento da formação de butanol é limitado pelo nível de expressão de CA_C0764, o gene que codifica a ferredoxina-NADP+ redutase e o operon bcd, que codifica uma ferredoxina-NAD+ redutase. A integração destas enzimas em estratégias de engenharia metabólica introduz oportunidades para o desenvolvimento de uma cepa homobutanologênica de C. acetobutylicum.

Clostridium acetobutylicum é uma bactéria anaeróbica Gram-positiva formadora de esporos, capaz de converter vários açúcares e polissacarídeos em ácidos orgânicos (acetato e butirato) e solventes (acetona, butanol e etanol). Devido à sua importância na produção industrial dos produtos químicos a granel acetona e butanol1,2,3 e ao seu potencial uso na produção de n-butanol, um promissor combustível líquido de base biológica com diversas vantagens sobre o etanol4,5, muitas pesquisas têm se concentrado em ( i) compreensão da regulação da formação de solventes6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e (ii) engenharia metabólica deste microrganismo para produzir altos rendimentos de álcoois16,17,18.

Utilizando uma abordagem de biologia de sistema global para a caracterização do metabolismo solventegênico de uma cultura quimiostática limitada por fosfato de C. acetobutylicum, as seis etapas envolvidas na conversão de acetil-CoA em butanol (Fig. 1) foram previamente caracterizadas: a enzima principal responsável pela redução de crotonil-CoA em butiril-CoA mostrou ser o complexo BCD (codificado por bcd, etfB e etfA, o operon bcd), uma enzima bifurcada que consome dois moles de NADH e produz um mol de ferredoxina reduzida, e o Foi demonstrado que as duas últimas etapas da produção de butanol são catalisadas por AdhE1 através de sua atividade de aldeído desidrogenase dependente de NADH e por BdhB, BdhC e BdhA através de sua atividade de butanol desidrogenase dependente de NADPH. Estes resultados tiveram um forte impacto na distribuição do fluxo de elétrons, pois foi demonstrado que ambas as atividades da ferredoxina-NADP+ redutase e da ferredoxina-NAD+ redutase eram necessárias para produzir o NADPH e o NADH extra necessário para a síntese de butanol a partir de acetil-CoA (Fig. 2) 19. Embora as atividades dessas enzimas tenham sido previamente detectadas em C. acetobutylicum6,20, os genes codificadores permaneceram desconhecidos19,21. As enzimas ferredoxina-NADP+ redutase (FNOR) (EC 1.18.1.3) estão distribuídas por uma variedade de organismos aeróbicos, de procariontes a eucariotos, especialmente em plantas22, mas nunca foram purificadas e caracterizadas de qualquer espécie de clostrídio. Em contraste, a redução de NAD+ dependente de ferredoxina acoplada à exportação de prótons (Rnf) e transidrogenases dependentes de ferredoxina (Nfn) foram caracterizadas do ponto de vista molecular em várias espécies de clostridios, mas nenhum homólogo foi encontrado em C. acetobutylicum . Além disso, C. acetobutylicum demonstrou ser incapaz de produzir NADPH pela via oxidativa da pentose-fosfato, pois faltava um gene que codifica uma glicose-6-P desidrogenase, a primeira e principal enzima desta via .

A caixa verde indica os produtos primários em condições acidogênicas, enquanto a caixa vermelha indica os produtos primários em condições solventegênicas. As letras em vermelho e itálico indicam os genes correspondentes. ack acetato quinase, adc acetoacetato descarboxilase, adhE1 aldeído desidrogenase, adhE2 bifuncional aldeído/álcool desidrogenase, alsD alfa-acetolactato descarboxilase, alsS acetolactato sintase, bcd butiril-CoA desidrogenase, bdh butanol desidrogenase, buk butirato quinase, crt crotonase , ctfAB CoA-transferase , flavoproteína de transferência de elétrons etf, hbd 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase, hidrogenase, fnor ferredoxina-NAD(P)+ oxidoredutases, pdc piruvato descarboxilase, pfor piruvato:ferredoxina oxidorredutase, pta fosfotransacetilase, ptb fosfotransbutirilase, thl tiolase, gapC dependente de NADH gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase produtora de NADPH não fosforilante, Fd ox representa ferredoxina oxidada, enquanto Fd red representa ferredoxina reduzida.